SPE經典案例分析——在方法偏離的情況下如何對實驗過程進行有效優化

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嗎？

文中仔細分析了在SPE的基本操作階段中

引發流速慢這類問題的主要原因。

今天我們主要給大家分享一下，

在方法偏離的情況下,

如何對實驗過程進行有效優化。

在實驗過程中，我們經常遇到方法偏離。方法偏離主要是發生在人機料法環測這幾個方面。實驗中經常遇到的樣品量不同，前處理儀器不同這些都是很常見的偏離問題。那么在面對這樣的問題的時候，我們該怎樣對于整個樣品前處理過程的產生一個合理分析并對實驗步驟進行有效的優化調整呢？

今天我們給大家分享一個案例，通過這個案例，希望對您的實驗有所啟發。

這個案例來自我們的客戶A。客戶A是做雪碧里合成著色劑檢測。參考標準是GB 5009.35-2016《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》。這個標準適用于飲料、配制酒、硬糖、蜜餞、淀粉軟糖、巧克力豆及著色糖衣制品中合成著色劑的測定，標準中用聚酰胺粉末吸附法或液液萃取分配法提取食品中人工合成著色劑，將其制成水溶液，再用高效液相色譜儀分析。這個國標的檢測方法比較繁瑣，并且赤蘚紅不能與其他色素一起測定，應用到實際檢測時，很多老師都覺得實驗過程過于復雜，難于操作。

針對這個國標，安譜實驗對其方法進行了優化，并且成功開發了食品中合成著色劑檢測小柱。采用高效液相色譜法來同時檢測食品中8種合成著色劑（莧菜紅、新紅、赤蘚紅、胭脂紅、日落黃、檸檬黃、亮藍，靛藍），方法簡單易行，且回收率高，深受廣大用戶的歡迎。

案例中的客戶A就是使用安譜實驗的合成著色劑小柱（SBEQ-CA73-GBT5009.35）來實驗的。客戶在20g的雪碧樣品里面加20ul,1000ug/ml的色素混標，采用全自動固相萃取儀按照安譜實驗合成著色劑柱的實驗方法中SPE的洗脫程序運行，結果發現亮藍在的回收率不佳。客戶希望我們能幫忙優化下實驗方法。

面對客戶對實驗步驟優化的訴求，我們仔細分析了客戶目前的實驗方法。

根據表格中兩種方法的對比，可以看出客戶和安譜實驗合成著色劑柱方法主要不同點是樣品量不同而帶來的。一是客戶是按照國標的取樣要求，需要20g的樣品。而我們實驗單頁的樣品取樣量則為1g，具體到上樣量，客戶的上樣量是約23ml，而我們的上樣量約12ml。客戶的上樣量約為我們的2倍，二是客戶的淋洗液和洗脫液也根據上樣量而都擴大了2倍。后就是客戶是用自動固相萃取裝置進行SPE操作的，和手動的固相萃取方法在流速控制上還是有差異的。由此可見，客戶的方法偏離主要體現在樣品取樣量，溶劑體積以及所用的儀器上。

客戶反饋實驗結果亮藍的回收率不佳，希望能夠改善亮藍的回收率。針對客戶的訴求，我們應該有如下思路來解決這個回收率的問題。

1  確定目標化合物主要損失步驟

亮藍的回收率不佳，說明亮藍在洗脫前的實驗過程中有損失。針對這種情況，我們需要先確定亮藍的主要損失步驟。

這里我們可以引入SPE操作過程中一個非常實用的實驗技巧——分步收集。

分步收集就是通過收集上樣液，淋洗液，洗脫液,并上機分析，從而判斷目標化合物具體損失的環節，明確實驗步驟中具體需要優化的環節。

根據我們的建議，客戶先實施了分步收集，發現亮藍在上樣液中未被檢出，淋洗環節有檢出。說明亮藍在小柱上能夠很好的被吸附，所以上樣液中無亮藍。但是在淋洗的時候被洗脫下來，所以淋洗部分是亮藍回收率損失的主要部分。

2  分析目標化合物主要損失的原因

通過前面分步收集，我們發現客戶的樣品中亮藍的主要是在淋洗過程中損失的。那么接下來就需要根據實驗原理分析亮藍損失的原因。

合成著色劑小柱的填料可與酚類、酸類、蒽醌類等成分形成氫鍵，因而產生吸附作用。合成著色劑的分子結構中帶有磺酸基團，羥基等。故能在酸性溶液中能與人工合成色素形成氫鍵牢固地結合，從而與天然色素、蛋白質、脂肪、淀粉等物質分離。然后在堿性條件下能夠解吸色素。但填料對天然色素的吸附并不不緊密，天然著色劑在酸性條件下能夠被去除。所以在我們的實驗過程中，會用甲醇-甲酸-水溶液去淋洗小柱，去除天然色素的干擾。

根據實驗原理我們不難發現，淋洗的目的主要是去除天然色素的干擾。而我們的目標化合物亮藍是一種易溶于水的合成著色劑。不難發現，在這種情況下，淋洗溶液和亮藍之間也會存在一定的分子間作用力，當淋洗液體積達到一定程度的時候，極易溶于水的亮藍就容易被淋洗液淋洗下來。

3  提出合理的改進意見

根據前面的步驟我們發現淋洗液和目標化合物亮藍之間的分子間作用力可能是造成亮藍損失的主要原因。那么在這種情況下我們需要怎樣改進實驗過程呢？針對這個案例我們考慮到客戶基質是碳酸飲料雪碧，本身基質中成分比較簡單。而淋洗的目的主要是去除天然色素，所以在對于雪碧這種基質而言淋洗這一步并不是關鍵步驟，可以減少用量。建議將10ml的淋洗液體積降至5ml，并且適當降低流速。

4  實驗驗證

客戶根據我們的建議改進實驗條件后，發現亮藍在淋洗時不再被洗脫下來，回收率能達到實驗要求。

根據上面的案例分析，我們不難發現，在面對實際檢測工作中的方法偏離問題時，我們需要做的是冷靜的比較方法的主要偏離點，并明確目標化合物的主要損失步驟，經過仔細思考，大膽推測，認真實驗驗證找到解決問題的方向。

路漫漫其修遠兮，

吾將上下而求索。

實驗過程本身就是不斷探索創新的過程，

遇到困難和問題不用慌張，

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